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Différents types de microscopes et la physique qu’il y a derrière

jeudi 20 juin 2019, par Robert Paris

Différents types de microscopes et la physique qu’il y a derrière

Avertissement : certaines remarques ou caractéristiques des appareils peuvent avoir vieilli et ne plus être valables. Nous indiquons les dates de parution des ouvrages cités.

La microscopie est un ensemble de techniques d’imagerie des objets de petites dimensions. Quelle que soit la technique employée, l’appareil utilisé pour rendre possible cette observation est appelé un microscope. Il existe différents types de microscopes et la physique qui est concernée n’est pas la même.

Il existe des microscopes d’espèces très diverses et la physique qu’il y a derrière chacune des sortes d’appareils est différente, fondée sur des effets électriques, magnétiques, optiques, électroniques, ioniques, photoniques, quantiques (tunnel), etc. Cependant, il est possible de comparer les valeurs caractéristiques de ces appareils que sont :

- le grossissement

- le pouvoir de résolution déterminé par la distance minimale pour distinguer les images de deux points séparés

- la netteté des images

- la valeur des aberrations sphériques des lentilles

- l’angle d’ouverture

- la longueur d’onde des émissions utilisées

La nouvelle microscopie utilise non seulement l’œil mais la photo et même le film (le petit dans l’espace peut devenir aussi le petit dans le temps, notamment avec le film femtoseconde (millionième de milliardième de seconde). La microscopie cesse de s’en tenir au visuel et utilise toutes les sortes de longueur d’onde et aussi toutes les sortes de particules et pas seulement les photons lumineux.

« L’histoire du microscope optique est inséparable de celle de l’optique, science de la vision et de la lumière. Les premiers instruments apparaissent fin XVIe début XVIIe siècle, avec le polissage des premières lentilles de verre qui réfractent la lumière selon les lois de l’optique géométrique. Durant le XVIIIe siècle, un système de lentilles achromatiques est mis au point. À la fin du XIXe siècle, Carl Zeiss, Ernst Abbe, August Köhler et Otto Schott édifient les bases de la microscopie moderne en produisant un objectif apochromatique qui réduit les aberrations et augmente son ouverture numérique. Abbe décrit l’imagerie du microscope en termes de capture d’ordres de diffraction dont les ordres supérieurs augmentent la résolution sans pouvoir dépasser la limite d’une demi-longueur d’onde. Au début du XXe siècle, l’optique devient calculatoire selon Joseph Fourier, amenant Fritz Zernike à concevoir le contraste de phase puis Georges Nomarski à développer le contraste interférentiel de phase. Puis la lumière devient quantique interagissant avec la matière. Du photon naît la fluorescence et le laser qui mènent au microscope confocal à balayage laser. À la fin du XXe et début XXIe siècle, la microscopie devient « superrésolue » permettant d’observer des objets de dimension sublongueur d’onde en modifiant l’éclairage (SIM, STED), par localisation de molécules uniques (PALM, STORM), détection d’ondes évanescentes (TIRF, hyperlentilles). » Source

« Dictionnaire de physique » de Elie Lévy (édité en 1988) :

« Le microscope optique

« Instrument destiné à observer des objets dont les dimensions sont trop réduites pour une observation satisfaisante à l’aide d’une simple loupe. Un microscope se compose d’un objectif et d’un oculaire fixés aux extrémités d’un même tube. L’objectif, association de plusieurs lentilles, plus rarement de miroirs, donne de l’objet une image réelle, l’image objective, que l’on observe à l’aide de l’oculaire comme on observerait un objet à l’aide d’une loupe, d’où le nom « loupe composée » donné parfois au microscope.

La présence de l’objectif se traduit par une « puissance » et un « grossissement » accrus, multipliés par le « grandissement » de l’objectif, et celui peut atteindre une centaine d’unités !

Mais la qualité essentielle d’un microscope réside dans sa « limite de résolution »…

On démontre que, si le diamètre du cercle oculaire de l’instrument possède une valeur avoisinant 0,5 mm – le grossissement pour cela doit avoir une valeur dite « optimale » -, la limite de résolution de l’ensemble instrument-œil, supposés parfaits du point de vue de l’optique géométrique, est alors imposée par les phénomènes de diffraction et vaut sensiblement 0,6 fois la longueur d’onde de la lumière utilisée divisée par l’ouverture numérique de l’objectif.

L’effort principal dans les microscopes visuels, dans lesquels la longueur d’onde voisine 0,5 micron, porte sur l’amélioration de l’ouverture numérique. Celle-ci vaut le produit de l’indice de réfraction du milieu d’incidence multiplié par le sinus de l’ouverture angulaire du faisceau incident. On augmente l’indice de réfraction en plaçant entre l’objet et l’objectif un liquide d’indice élevé et on augmente l’ouverture angulaire en calculant l’objectif de façon à pouvoir l’utiliser en faisceaux très largement ouverts, sans aberrations sensibles. On a pu réaliser des ouvertures voisines de 1,5, ce qui confère à ces microscopes visuels une limite de résolution voisine de quelques dixièmes de micron. On a étudié des microscopes utilisant de la lumière ultra-violette de longueur d’onde plus faible. Mais l’amélioration la plus importante du pouvoir de résolution a été obtenue avec les microscopes électroniques. » « Le microscope électronique

« La mécanique ondulatoire, qui associe une onde à toute particule en mouvement, suggère qu’il puisse exister des instruments, analogues aux instruments d’optique, dans lesquels les photons des appareils visuels seraient remplacés par des particules matérielles. On sait effectivement réaliser, depuis 1932, des microscopes à électrons, ou microscopes électroniques (Ernst Ruska, Nobel 1986).

Un canon à électrons remplace la source lumineuse et envoie des faisceaux électroniques à travers l’objet, pris sous forme de préparation ultramince (quelques centièmes de micron). Des lentilles électriques, ou magnétiques, incurvent ces rayons et l’on retrouve sur une plaque photographique convenablement placée l’image agrandie de l’objet. Un agrandissement de 100.000 est couramment atteint.

L’intérêt majeur de ces appareils réside dans l’amélioration qu’ils ont permise des limites de résolution. La longueur d’onde de l’onde associée peut être cent mille fois plus faible que celle de la lumière visible. (0,04 angström par exemple au lieu de 0,4 micron).

Les lentilles électroniques actuelles ne peuvent malheureusement être utilisées qu’en faisceaux étroits, on ne sait pas encore corriger leurs aberrations en faisceaux larges. Leur ouverture numérique est donc moins avantageuse que celle des microscopes visuels. Au total, on a pus atteindre des limites de résolution de quelques dizaines d’angströms, ordre de grandeur des dimensions moléculaires. »

« Le microscope ionique (ou à effet de champ, ou à champ ionisant)

« Ce n’est pas à proprement parler un microscope avec objectif et oculaire, mais un instrument donnant directement une image agrandie de la surface d’une pointe métallique. Il fut inventé en 1950 par Erwin Müller. Dans une ampoule contenant un gaz rare, de l’hélium par exemple, sous faible pression, une pointe métallique (diamètre de l’ordre de dix nanomètres) est placée face à un écran fluorescent. Une tension électrique est établie entre le métal (positif) et l’écran (négatif). Au voisinage de la pointe on crée ainsi un champ électrique. Son intensité, qui peut atteindre dix milliards de volts par mètre, est plus forte au voisinage immédiat des régions où la surface est bosselée par la présence d’atomes du métal (pouvoir des pointes). Les atomes gazeux voisins sont polarisés, attirés vers chacune de ces régions, puis ionisés. Les électrons qui en résultent sont fixés sur le métal, tandis que les ions positifs sont chassés, le long des lignes de champ divergentes, vers l’écran qu’ils impressionnent.

Les taches sur l’écran reproduisent ainsi, sous forme agrandie, la répartition des atomes sur la surface de la pointe métallique. On a pu réaliser des grandissements de l’ordre de dix millions et reconnaître par exemple la structure cristalline superficielle d’une pointe de tungstène, d’or ou de platine, repérer un à un des atomes étrangers déposés sur la pointe et même dans certains cas observer, en comparant des cliches successifs, des déplacements de ces atomes. Un microscope à effet de champ est parfois utilisé pour contrôler la qualité de la pointe métallique qui doit ensuite servir au fonctionnement d’un microscope à effet tunnel. »

« Le microscope à effet tunnel

« Instrument que l’on doit à Gerd Binnig et Heinrich Rohrer (Nobel 1986°. C’est un instrument sans objectif ni oculaire comme le microscope à champ ionisant d’E. Müller, mais qui présente sur ce dernier l’avantage de donner des informations sur la structure cristalline, non plus seulement d’une pointe mais d’une surface étendue.

Son fonctionnement est fondé sur le fait que si une pointe métallique est placée à une très faible distance (environ un nanomètre) de la surface d’un corps conducteur ou semi-conducteur, et si l’on maintient entre surface et pointe une tension électrique, même très faible (quelques dizaines de millièmes de volt suffisent), des électrons peuvent passer de la surface vers la pointe à travers la faible épaisseur d’espace vide qui les sépare, par « effet tunnel ». Il s’établit donc un courant électrique, dont l’intensité décroît exponentiellement lorsque la distance entre surface et pointe augmente. D’où la possibilité de déterminer une carte en relief de la surface étudiée.

Dans ce but une fine aiguille métallique est fixée sur un corps piézoélectrique dont les variations d’épaisseur, excitées par une tension auxiliaire ajustable, commandent les déplacements de l’aiguille perpendiculairement à la surface, pendant que deux autres organes la déplacent transversalement de façon à lui faire balayer la surface point par point. Un système d’asservissement ajuste en chaque point la tension auxiliaire de façon que le courant demeure constant, ce qui veut dire que la pointe de l’aiguille reste pendant le balayage à distance constante de la surface. Des variations de la tension qui produisent ce résultat, on déduit les lignes de niveaux de la surface, ce qui permet de déceler par exemple les emplacements des atomes superficiels. »

Richard Feynman dans son Cours de Physique (Electromagnétisme 2) – édité en 1964 :

« Le microscope électronique

« Vous savez que les microscopes électroniques permettent de voir des « objets » trop petits pour être vus avec des microscopes optiques. Nous avons étudié les limites théoriques de tout système optique, dues à la diffraction par les ouvertures des lentilles. Si l’ouverture d’une lentille sous-tend un angle de deux fois l’angle, à partir de la source, deux points voisins de la source ne peuvent être vus séparés s’ils sont plus proches que, environ, la longueur d’onde la lumière divisée par le sinus de l’angle ;

Avec le meilleur microscope optique, l’angle est voisin de la limite théorique de 90°, donc la distance minimale pour distinguer deux points est à peu près égale à la longueur d’onde, soit environ cinq mille angströms.

La même limite s’applique aussi au microscope électronique, mais ici, la longueur d’onde vaut – pour des électrons de 50 kilovolts – environ 0,05 angström. Si l’on pouvait se servir d’une lentille d’ouverture voisine de 30°, on pourrait séparer des objets distants de 1/5 d’angström seulement. Comme dans les molécules, les atomes sont en général distants de un ou deux angströms, nous pourrions voir des photographies de molécules. La biologie serait facile ; nous aurions une photographie de l’ADN. Comme ce serait sensationnel ! La plupart des recherches actuelles en biologie moléculaire consistent à essayer de représenter la forme des molécules organiques complexes. Si seulement nous pouvions les voir !

Malheureusement, le meilleur pouvoir de résolution réalisé dans un microscope électronique est plutôt de l’ordre de 20 angströms. C’est que personne n’a encore conçu de lentille à grande ouverture. Toutes les lentilles ont des « aberrations sphériques », c’est-à-dire que les rayons très inclinés sur l’axe ont un point de focalisation différent de celui des rayons peu inclinés. Grâce à des techniques particulières, les lentilles des microscopes optiques peuvent être faites avec une aberration sphérique négligeable, mais personne jusqu’ici n’a réussi à faire une lentille pour électrons dépourvue d’aberration sphérique.

En fait, on peut montrer que toute lentille électrostatique ou magnétique du type de celles qui viennent d’être décrites doit comporter une certaine aberration sphérique irréductible. Cette aberration – jointe à la diffraction – limite les pouvoirs de résolution des microscopes électroniques à leur valeur actuelle.

La limite que nous venons de mentionner ne s’applique pas aux champs électriques et magnétiques qui n’ont pas de symétrie axiale, ou qui ne sont pas constants dans le temps. Peut-être un jour découvrira-t-on un nouveau type de lentille pour électrons qui surmontera la difficulté de l’aberration inhérente à la simple lentille. Alors on pourra directement photographier des atomes. Peut-être un jour fera-t-on l’analyse des composés chimiques en regardant les positions des atomes plutôt qu’en regardant la couleur d’un précipité ! »

Richard Feynman dans son Cours de Physique (Electromagnétisme 1) – édité en 1964 :

« Le microscope à émission de champ

« Si nous chargeons un conducteur qui n’est pas une sphère mais une pointe ou une extrémité très aigüe, le champ au voisinage de la pointe est beaucoup plus grand que le champ dans les autres régions. La raison en est, qualitativement, que les charges essaient de s’étendre le plus possible sur la surface d’un conducteur, et que l’extrémité d’une pointe aigüe se trouve aussi loin qu’il est possible de la plus grande partie de la surface. Certaines charges sur la plaque sont poussées vers l’extrémité. Une quantité de charges relativement petite au sommet peut encore fournir une grande densité superficielle ; une densité de charges élevée implique un champ intense juste à l’extérieur…

Ce résultat est techniquement très important parce que l’air peut cesser d’être isolant si le champ électrique est trop grand. Ce qui arrive, c’est qu’une charge libre (électron ou ion), quelque part dans l’air est accélérée par le champ, et que si le champ est très grand, la charge peut acquérir, avant de frapper un autre atome, une vitesse suffisante pour lui permettre d’arracher un électron à cet atome. Ce qui a pour résultat de créer de plus en plus d’ions. Leur mouvement forme une décharge ou étincelle. Si vous voulez porter un objet à un potentiel élevé et qu’il ne se décharge pas par des étincelles dans l’air, vous devez vous assurer que la surface est lisse, de sorte qu’il n’y ait pas d’endroit où le champ est anormalement grand.

Il existe une application intéressante du champ électrique extrêmement élevé qui entoure toute protubérance aigüe sur un conducteur chargé. Le microscope à émission de champ dépend pour son fonctionnement du champ élevé créé sur une pointe métallique aigüe. Il est construit de la façon suivante. Une très fine aiguille, ayant une extrémité dont le diamètre est environ de mille angströms, est placée au centre d’une sphère de verre dans laquelle on a fait le vide. La surface intérieure de la sphère est recouverte d’une mince couche conductrice d’un matériau fluorescent, et l’on applique une différence de potentiel très élevée entre la couche fluorescente et l’aiguille.

Examinons d’abord ce qui se passe quand l’aiguille est négative par rapport à la couche fluorescente. Les lignes de champ sont fortement concentrées sur la pointe aigüe. Le champ électrique peut être aussi élevé que 40 millions de volts par centimètre. Dans des champs aussi intenses, des électrons sont arrachés de la surface de l’aiguille et accélérés par la différence de potentiel entre l’aiguille et la couche fluorescente. Lorsqu’ils atteignent celle-ci, ils provoquent une émission lumineuse, tout comme dans un tube image de télévision.

Les électrons qui arrivent en un point donné de la surface fluorescente sont, avec une excellente approximation, ceux qui quittent l’autre extrémité de la ligne de champ radiale, car les électrons se déplacent le long de la ligne de champ allant de la pointe à la surface.

Nous voyons ainsi sur la surface une sorte d’image de la pointe de l’aiguille. Plus précisément, nous voyons une image de l’émissivité de la surface de l’aiguille – qui représente la facilité avec laquelle les électrons peuvent quitter la surface de la pointe métallique.

Si la résolution était suffisamment élevée, on pourrait espérer distinguer les positions des atomes individuels à l’extrémité de l’aiguille. Avec des électrons, cette résolution n’est pas possible pour les raisons suivantes. D’abord, il y a la diffraction quantique des électrons qui brouille les images. Ensuite, à cause de leurs mouvements à l’intérieur du métal les électrons ont une petite vitesse initiale transversale lorsqu’ils quittent l’aiguille, et cette composante transverse aléatoire de la vitesse contribue à rendre l’image floue. La combinaison de ces deux effets limite la résolution à 25 Angströms ou à peu près.

Si, cependant, nous inversons la polarité et introduisons une petite quantité d’hélium gazeux dans l’ampoule, il est possible d’atteindre des résolutions beaucoup plus élevées. Lorsqu’un atome d’hélium entre en collision avec la pointe de l’aiguille, le champ intense qui y règne dépouille d’un électron l’atome d’hélium, et le laisse chargé positivement. L’ion hélium est ensuite accéléré vers l’extérieur le long d’une ligne de champ aboutissant à l’écran fluorescent. Comme les ions hélium sont beaucoup plus lourds que les électrons, les longueurs d’ondes quantiques sont beaucoup plus petites. Si la température n’est pas trop élevée, l’effet des vitesses thermiques est aussi plus faible que dans le cas de l’électron. Avec moins de brouillage de l’image, on obtient une photo de la pointe beaucoup plus fine. Il a été possible d’obtenir des grossissements de deux millions de fois avec le microscope à émission de champ à ions positifs – grossissement qui est dix fois meilleur que celui qui est obtenu avec le meilleur microscope électronique. »

Lochak, Diner et Farge dans « L’objet quantique » (édité en 1989) :

« La diffraction des électrons : amie ou ennemie du microscope électronique ?

« Le phénomène de la diffraction des électrons, tout comme celui de la lumière sera pour nous tantôt ami tantôt ennemi selon les appareils que nous construirons.

Prenons d’abord le cas du microscope électronique, qui est a priori défavorable.

On savait, depuis le siècle dernier, qu’il existe une borne infranchissable au grossissement du microscope optique, qui est imposée par la nature ondulatoire de la lumière. En effet, en raison de la diffraction des ondes à travers l’objectif du microscope, l’image d’un point n’est pas un point mais une tâche de l’ordre de la longueur d’onde lumineuse, donc environ de l’ordre du micron. Certes, on pourrait encore jouer un peu sur la géométrie de l’appareil, mais on perdrait le gain obtenu en provoquant d’autres aberrations. Ceci limite donc le pouvoir séparateur du microscope (c’est-à-dire notre capacité de distinguer sur l’image deux points différents de l’objet) et, par là-même le grossissement utile du microscope optique ne peut dépasser 2000 à 25000 fois : rien ne sert de grossir si c’est pour obtenir du flou.

Mais depuis lors (vers 1930), on a inventé le microscope électronique dans lequel le faisceau lumineux est remplacé par un faisceau d’électrons et les lentilles optiques en verre par des lentilles magnétiques qui dévient et concentrent le faisceau d’électrons reproduisant les conditions habituelles de l’optique géométrique instrumentale…

La formule de De Broglie (longueur d’onde multipliée par masse multipliée par vitesse égale le quanta d’action de Planck h) montre que la longueur d’onde de l’électron diminue si on augmente la vitesse des électrons. D’où la recette pour augmenter le grossissement du microscope : il faut augmenter la tension sous laquelle on accélère les électrons. A condition, bien sûr, qu’on réduise en même temps les autres sources d’aberration, ce qui a été réalisé au moins en partie. L’idée d’augmenter la vitesse des électrons est même meilleure qu’il n’y paraît parce que la relativité vient à notre aide : elle enseigne qu’à des vitesses suffisamment grandes, la masse de l’électron augmente, contribuant encore à diminuer la longueur d’onde.

On a construit des microscopes qui vont jusqu’à 5 millions de volts… Mais en réalité on se trouve limité par d’autres sources d’aberration, par les difficultés de construction et parce que des électrons trop rapides finissent par détruire les échantillons observés.

Les microscopes les plus courants vont de quelques dizaines de milliers à quelques centaines de milliers de volts. Un grossissement de quelques dizaines de milliers de fois (donc dix ou vingt fois mieux que les meilleurs télescopes optiques) est très banal et les services rendus à la médecine, à la biologie et à la technologie sont immenses. Mais la biologie utilise des grossissements allant jusqu’à plusieurs centaines de milliers de fois.

Rappelons que le microscope optique permet de voir les bactéries, tandis que le microscope électronique permet de voir les virus….

On peut même voir les atomes ! En effet, dans un microscope à un millions de volts, la longueur d’onde de l’électron n’est plus que de un centième d’angström (dix puissance moins dix centimètre), soit un millions de fois moins que celle de la lumière visible. En tenant compte d’autres aberrations, ce microscope pourra séparer, sur l’objet observé, deux points distincts d’un angström (dix puissance moins huit centimètres)… »

« Les microscopes à rayons X

« Au lieu de se borner à enregistrer l’image des objets tels quels, à leur échelle, on peut essayer de faire mieux et d’en profiter pour agrandir en même temps les détails. Ce n’est guère facile avec les rayons X, puisque, comme on vient de le dire, on ne sait pas construire des lentilles sur le même principe que pour la lumière.

Ce serait cependant très intéressant car le pouvoir de pénétration des rayons X permettrait de voir en profondeur des objets aussi essentiels que des cellules vivantes, oud es circuits intégrés. On sait déjà un peu le faire grâce au microscope électronique à transmission, mais avec de sérieux inconvénients. Tout d’abord, l’épaisseur traversée est faible, une centaine d’angströms (ce qui représente seulement quelques dizaines d’atomes !), à cause de la forte interaction des électrons avec la matière.

D’autre part, l’échantillon à observer doit être placé sous vide, car les électrons sont tout de suite arrêtés par l’air ; ceci implique des préparations longues des objets à observer, et qui, surtout en biologie, risque de les modifier profondément. Un microscope à rayons X permettrait de s’affranchir de ces contraintes…

La résolution de ces microscopes atteint dès maintenant cinq cent angströms, ce qui est déjà dix fois mieux que les microscopes optiques ; mais encore très loin des microscopes électroniques, qui frôlent l’angström, c’est-à-dire les dimensions d’un seul atome… »

« Si la diffusion des rayons X nous donne des renseignements sur les assemblages d’atomes, les raies d’émission X sont typiques des couches électroniques profondes des atomes. Elles sont donc peu sensibles aux liaisons entre les atomes, qui n’affectent que les électrons périphériques, ceux qui sont responsables du rayonnement visible. On tient donc avec les émissions X une méthode extrêmement puissante d’analyse qui va nous révéler, en toutes circonstances, la nature des atomes qui composent un échantillon, c’est-à-dire faire une analyse chimique. Et ceci sans avoir à détruire l’échantillon, comme dans les méthodes classiques, qui utilisent des réactions caractéristiques, ou encore l’étude du spectre lumineux visible, qui exige de vaporiser l’échantillon dans une flamme.

L’appareil le plus remarquable dans ce domaine est la microsonde électronique, croisement heureux entre un microscope électronique à balayage et un spectromètre à rayons X. Dans l’appareil, le faisceau électronique balaie la surface de l’échantillon, tout à fait comme dans un microscope électronique à balayage, mais cette fois-ci le signal recueilli est constitué à partir des rayons X réémis par le petit domaine frappé par le faisceau d’électrons. En outre un savant dispositif mécanique ou électronique permet de sélectionner une longueur d’onde caractéristique, si bien que l’intensité du signal dépend de l’abondance d’une seule espèce atomique. En quelque sorte, on peut régler l’appareil pour ne « voir » que les atomes de fer, ou de silicium, etc. Enfin, le domaine ainsi analysé est très petit, inférieur au millième de millimètre. »

Microscopies en champ proche, Dimitri Roditchev, pour l’Université de tous les savoirs

« L’invention, en 1981, du microscope à effet tunnel (STM de Scanning Tunneling Microscope) par Gerd Binning et Heinrich Rohrer a ouvert un champ très vaste d’investigations scientifiques et d’applications technologiques… Depuis l’invention de ce microscope, tout un ensemble d’autres microscopies sont apparues :

* Le microscope à force atomique, qui permet d’imager avec la résolution atomique la surface d’un isolant,

* Le microscope à force magnétique, qui permet de déterminer la structure magnétique d’un échantillon,

* Le microscope à conductance ionique, qui n’a pas la résolution atomique mais qui permet de visualiser en milieu liquide la surface d’une membrane biologique,

* Le microscope optique à onde évanescente, qui permet d’imager des réseaux optiques avec une résolution de 10 nanomètres, etc.

Tous ces microscopes ont un principe commun : une pointe-sonde est promenée au-dessus de la surface à analyser et l’image se fait en mesurant localement l’interaction entre la surface et la pointe. Cette interaction dépendant de la structure locale de l’échantillon, on dispose ainsi une sonde locale dans l’espace réel. Toutes les autres microscopies plus anciennes d’analyse des surfaces, qui font une moyenne sur la surface du faisceau incident (un millimètre carré à un micromètre carré) et qui s’accompagnent de phénomènes de diffraction, ne permettent pas de voir les détails fins de la surface. »

Les types de microscopes

Microscope de lumière transmise (microscope optique)

Les microscopes de lumière transmise servent à contempler des préparations transparentes et très fines. Au plus la préparation est fine, au plus vous pourrez l’observer avec précision. Cependant, vous pouvez utiliser les microscopes de lumière transmise pour voir la surface d’échantillons de corps opaques, comme par exemple, des granulés ou des dépôts. Dans ces cas-là, la préparation s’observe comme un jeu de lumière et d’ombres. Sur ces types de microscopes le rayon de lumière est normalement projeté d’en bas, en traversant la préparation lorsqu’elle est transparente. Si vous souhaitez bien contempler les préparations spéciales qui sont disposées sur la platine, il est recommandé d’utiliser un microscope inversé. Sur ces types de microscopes, l’éclairage est du haut vers le bas. La microscopie inversée s’utilise avec fréquence dans l’hydrogéologie, l’hydrobiologie et la médecine. Etant donné que le type de construction implique que la distance entre l’objet et l’objectif soit assez grand, cela rend possible la contemplation de préparations plus épaisses.

Microscope de lumière réfléchie (microscope optique)

Sur ce type de microscope, la préparation s’éclaire de la partie supérieure à travers de l’objectif ou de façon latérale. La lumière réfléchie sur la préparation est captée par l’objectif. Grâce à cette technique, il est possible d’utiliser des préparations opaques ou épaisses. Les microscopes de lumière réfléchie s’utilisent fréquemment dans la microscopie de fluorescence ou dans la minéralogie

Le principal intérêt de la microscopie en lumière réfléchie est de permettre l’examen des objets opaques à l’état frais, sans devoir les couper ni les dépigmenter. En entomologie, par exemple, l’instrument rend les plus grands services. Mais le domaine où il est le plus largement utilisé est l’étude des matériaux, et plus spécialement la métallographie (microscopes métallographiques).

Microscope stéréoscopique (microscope optique)

Les microscopes stéréoscopiques sont principalement des microscopes de lumière réfléchie. La préparation est en général éclairée de la partie supérieure ou inférieure. La plupart des microscopes stéréoscopiques permettent d’éclairer aussi de la partie inférieure. Les microscopes stéréoscopiques se différencient d’autres microscopes car ils disposent de deux entrées de lumière séparées, qui sont rangées dans un angle déterminé. Chaque entrée de lumière intègre son propre objectif et oculaire. Certains microscopes stéréoscopiques intègrent une lunette d’augmentation intégrée devant l’objectif.

Les microscopes stéréoscopiques, ou stéréo microscopes, sont parfois appelés aussi loupes binoculaires, microscopes binoculaires, ou encore binoculaires tout court, mais improprement. En effet, la plupart des microscopes binoculaires ne sont pas stéréoscopiques... Par définition, un microscope stéréoscopique est un instrument qui permet de percevoir le relief d’un objet par examen de deux images prises avec un écartement comparable à celui des yeux. Il faut donc qu’il comprenne non seulement deux oculaires, mais également deux objectifs. Donc, le microscope stéréoscopique est un instrument destiné essentiellement à l’observation de la structure extérieure, du relief des objets. Conventionnellement, c’est un éclairage incident qui est utilisé, car celui-ci favorise grandement la vision stéréoscopique en produisant des jeux d’ombre à la surface de l’objet.

Avec un tel dispositif d’éclairage, seuls les rayons réfléchis par le spécimen sont captés par l’œil de l’observateur. Les rayons lumineux n’ayant pas à traverser l’objet, celui-ci ne doit pas nécessairement être transparent, et une certaine opacité est même souhaitable. Les dimensions de l’objet ne sont de ce fait pas limitées, si ce n’est par la mécanique de l’instrument. Les microscopes stéréoscopiques sont pourvus d’objectifs dont les qualités principales sont une grande distance frontale et un vaste champ d’observation. Ces qualités ne peuvent malheureusement êtres obtenues qu’au détriment du grossissement, qui n’excède jamais dix fois. C’est la raison pour laquelle le grossissement total des stéréo microscopes dépasse rarement deux cents fois (couplage d’un objectif dix fois avec un oculaire vingt fois). Pour ce qui est des intérêts mycologiques de l’instrument, ils sont multiples. Le stéréo microscope permet aussi bien l’observation confortable des caractères macroscopiques les plus ténus que l’étude et la détermination des petites espèces.

Microscope optique à fond noir

Avec le microscope à fond noir, seuls les rayons lumineux diffractés par l’objet concourent à la formation de l’image. C’est sur ce principe que repose le fonctionnement du microscope stéréoscopique. En effet, l’éclairage étant incident, aucun rayon lumineux ne peut pénétrer directement dans l’objectif, et ce sont uniquement les rayons réfléchis par l’objet qui parviennent à l’œil de l’observateur. On ne s’en aperçoit généralement pas, mais le stéréo microscope est bel et bien un microscope à fond noir, quoique d’un type un peu particulier. Mais le microscope à fond clair peut aussi devenir un microscope à fond noir. Il suffit pour cela d’occulter, par exemple à l’aide d’un diaphragme circulaire, tous les rayons directs émis par la source. L’objet est alors éclairé par un anneau de lumière, et seuls les rayons diffractés par lui sont collectés par l’objectif. Mais ce dispositif a le désavantage que peu de rayons parviennent jusqu’à l’observateur, ce qui oblige à utiliser un éclairage très intense, nuisible aux préparations. Voici un diaphragme tel que ceux qui sont utilisés pour occulter les rayons directs lors de l’examen en fond noir. En général, cet accessoire est combiné, pour améliorer la qualité de l’image, avec un condenseur spécial : le condenseur à fond noir.

Microscope optique à contraste de phase

Pour obtenir de bons résultats en fond clair, les objets doivent être contrastés. Pourtant, la plupart d’entre eux, à l’état naturel, le sont peu, et c’est pourquoi on a recours à une multitude de processus de coloration. Mais la plupart des substances colorantes sont toxiques et tuent les cellules, ce qui exclut l’observation de leur évolution au cours du temps. C’est ce qui a motivé la mise au point des microscopes à contraste de phase, qui permettent d’étudier les cellules les plus transparentes tout en les conservant vivantes. D’une manière générale, on peut distinguer, en microscopie, deux catégories d’objets : les objets d’amplitude et les objets de phase. Les corps plus ou moins colorés ou noirâtres, que ce soit naturellement ou après un traitement spécifique, constituent la catégorie des objets d’amplitude. Ce sont ceux que l’on étudie à l’aide du microscope à fond clair. Au contraire, les objets transparents, difficilement observables en fond clair, font partie des objets de phase. Ce sont ceux qui nous intéressent dans ce paragraphe. Il existe une différence théorique fondamentale entre ces deux catégories d’objets : les objets de phase déphasent les ondes lumineuses d’un quart de longueur d’onde (λ), ce qui ne se produit pas avec les objets d’amplitude. Le principe du microscope à contraste de phase est de compenser le déphasage que produisent les objets de phase par l’action d’une plaque de phase. Celle-ci ramène l’état de phase à celui qui serait donné par un objet d’amplitude et transpose ainsi les contrastes de phases en contrastes d’amplitudes ; l’objet transparent devient contrasté sans l’action de colorants. En plus de compenser le déphasage, les plaques de phase, pour accentuer le contraste, ont le pouvoir d’absorber une grande partie des rayons lumineux directs émis par la source, comme c’est le cas du fond noir. Une de ces plaques de phase est insérée à demeure dans chacun des objectifs d’un microscope à contraste de phase. C’est un éclairage annu-laire qui est mis en œuvre, et à chaque objectif correspond un diaphragme différent, centré sur la plaque de phase de l’objectif, et que l’on insère au niveau du condenseur. Pourtant, nombre de facteurs limitent l’utilisation du microscope à contraste de phase. Les objets doivent être peu, ou de préférence pas colorés ; ils ne doivent pas avoir de membranes épaisses et ils ne doivent pas eux-mêmes être épais ; ils ne doivent pas non plus couvrir tout le champ. Les surfaces optiques, tant du microscope que de la préparation, doivent être très propres, et l’éclairage doit être plus intense que pour le fond clair.

Microscope en fluorescence

Ici s’utilise en général un colorant fluorescent sur l’échantillon à travers une lumière avec une longueur d’onde déterminée depuis l’extérieur. Le colorant fluorescent émet la lumière. Cette lumière dispose d’une longueur d’onde plus grande que la lumière excitatrice (Soke’sShift). Dans la trajectoire du rayon, la lumière fluorescente peut être séparée de la lumière excitatrice à travers des filtres optiques et la renvoyer à l’oculaire ou à la caméra. La limite de résolution d’un microscope de fluorescence peut être très en-dessous d’un microscope optique conventionnel, ce qui permet de contempler avec précision les structures d’une cellule ou les processus de cellules vives.

La microscopie en fluorescence est basée sur la constatation que certains corps violemment éclairés par des radiations de courte longueur d’onde, l’absorbent en réémettant des radiations de longueur d’onde plus grande dites de fluorescence. Cette fluorescence résulte, en vérité, du déplacement des électrons d’une couche électronique à l’autre. En effet, lorsqu’un électron, dans le nuage électronique d’un atome, absorbe une radiation de longueur d’onde déterminée, il passe de l’état fondamental (état non excité) à l’état excité ; et cela se traduit par le déplacement de l’électron vers une couche périphérique. C’est en retournant à l’état fondamental que l’électron émet des radiations de fluorescence, de longueur d’onde plus grande que celle de la radiation absorbée. Mais la mise à profit de la fluorescence requiert un certain nombre de conditions expérimentales déterminées. Il est bien évident, par exemple, que le matériau dans lequel ont été façonnées les lentilles, ainsi que le baume qui les colle, ne peuvent être fluorescents. Il en est de même des lames porte-objets, des lamelles couvre-objets, du milieu de montage de la préparation, de l’huile à immersion éventuelle, etc. Pas question donc, lors de l’examen en fluoromicroscopie, de monter la préparation dans le baume du Canada ou d’utiliser l’objectif à immersion avec de l’huile de cèdre, car ces deux substances sont fortement fluorescentes. De plus, toutes les surfaces optiques, y compris celles de la préparation, doivent être parfaitement propres. D’autre part, pour obtenir les meilleurs résultats, il est nécessaire d’utiliser un rayonnement monochromatique, c’est-à-dire dont la longueur d’onde est homogène et bien déterminée (la lumière blanche, poly chromatique, ne peut convenir). Pour ce faire, on fait passer la lumière d’éclairage à travers un filtre d’absorption sélective, qui est généralement construit de manière à ne laisser passer que l’ultraviolet, dont la longueur d’onde est plus courte que celle de la lumière visible. Après que la lumière ait traversé la préparation, on lui fait franchir un second filtre, qui absorbe ce qui reste de la lumière excitatrice, et ne laisse passer que les radiations de fluorescence. L’examen en fluorescence est parfois associé avec le contraste de phase décrit précédemment, afin de permettre de localiser très précisément les points fluorescents dans la préparation. La polarisation peut également y être combinée. Il existe deux modalités d’examen en fluorescence, soit que l’objet est fluorescent naturellement, soit qu’il est rendu fluorescent suite au traitement par un fluorochrome (colorant fluorescent, tels la rhodamine, la fluorescéine, l’éosine jaunâtre, l’uranine, l’érythrosine bleuâtre, le rose Bengale, la phosphine, la benzoflavine, etc.). C’est principalement dans l’étude de la biologie des champignons, mais aussi, dans une moindre mesure, pour la détermination fine de ceux-ci, que la microscopie en fluorescence trouve des applications mycologiques... dans les laboratoires spécialisés, évidemment !

Microscope confocal (microscope optique ou de fluorescence)

Ce type de microscopie est une forme particulière de la microscopie optique ou fluorescente. Dans ce cas, des sections optiques très fines sont scannées et une image tridimensionnelle se compose. Etant donné que chaque section est une image très nette, une image 3D très bien mise au point est obtenue.

Un microscope confocal, appelé plus rarement microscope monofocal, est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet. L’objet n’est donc pas directement observé par l’utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur. Le microscope confocal fonctionne en lumière réfléchie ou en fluorescence. La plupart du temps, on utilise un laser comme source de lumière. On parle alors de microscope confocal à balayage laser — MCBL (en anglais CLSM pour confocal laser scanning microscope).

Microscope en ultraviolets

Les radiations ultraviolettes diffèrent de la lumière visible essentiellement par leur longueur d’onde plus courte. C’est cette propriété qui est mise à profit dans les microscopes à ultraviolets. En effet, plus la longueur d’onde d’une radiation est courte, plus le pouvoir séparateur de l’instrument qui l’utilise est grand. Le pouvoir séparateur d’un microscope à ultraviolets peut être jusqu’à deux fois supérieur à celui d’un microscope à fond clair conventionnel. En plus d’augmenter le pouvoir résolvant, les ultraviolets ont la propriété d’être absorbés par certains constituants cellulaires, tels les acides ribonucléiques. Ils permettent donc des observations complémentaires à celles qui sont faites en lumière visible. Mais les ultraviolets présentent de graves désavantages. Ainsi, par exemple, les sources lumineuses sont coûteuses et dangereuses pour l’œil, et les objectifs s’altèrent rapidement sous l’action catalysante des radiations ultraviolettes.

Microscope en infrarouges

L’intérêt des infrarouges n’est pas, comme c’est le cas des ultraviolets, d’augmenter le pouvoir résolvant les instruments. En effet, la longueur d’onde des infrarouges est sensiblement plus grande que celle de la lumière visible. Le pouvoir résolvant s’en trouve diminué, et les infrarouges ne sont donc pas destinés à des grossissements très élevés. Pourtant, certains objets tels les téguments des coléoptères, très opaques à la lumière visible, sont plus ou moins transpa-rents aux infrarouges. C’est en cela que réside essentiellement leur intérêt. Les microscopes à ultraviolets et à infrarouges sont des instruments spécialisés, d’emploi relativement compliqué et de bien piètre utilité dans le domaine des champignons. Inutile donc de s’étendre inconsidérément à leur sujet.

Microscope STED (Stimulated Emission Depletion) (Microscope de fluorescence)

Ce type de microscopie est une méthode plus récente que la microscopie de fluorescence, avec laquelle il est possible de contourner la limite de résolution définie par Abbe. L’avantage est qu’en comparant avec un microscope optique conventionnel, la limite de reproduction est supérieure, ce qui permet de focaliser avec plus de netteté des détails de structures. Avec le microscope STED vous obtenez une meilleure résolution qu’avec un microscope laser conventionnel. En octobre 2014, le chercheur Stefan Hell a été récompensé avec le prix Nobel de la chimie par ses travaux de recherche avec le microscope STED.

La microscopie par émission d’émissions stimulées (STED) est l’une des techniques qui composent la microscopie à super-résolution. Il crée des images de super-résolution par la désactivation sélective des fluorophores, minimisant ainsi la zone d’éclairage au point focal et améliorant ainsi la résolution pouvant être atteinte pour un système donné.

Microscope électronique

Dit d’une façon simple, la microscopie électronique utilise un faisceau d’électrons au lieu de lumière. Comme vous le savez, ceux-ci disposent d’une longueur d’onde beaucoup plus courte que la lumière visible, et une plus grande résolution est obtenue dans la plage des structures atomiques. Il existe une grande variété d’électrons. Nous indiquons ici seulement.

En microscopie électronique l’irradiation de l’échantillon se fait avec un faisceau d’électrons. Les microscopes électroniques utilisent des lentilles électrostatiques et des lentilles magnétiques pour former l’image en contrôlant le faisceau d’électrons et le faire converger sur un plan particulier par rapport à l’échantillon.

Les microscopes électroniques ont un plus grand pouvoir de résolution que les microscopes optiques et peuvent obtenir des grossissements beaucoup plus élevés allant jusqu’à 2 millions de fois.

Les deux types de microscopes, électronique et optique, ont une résolution limite, imposée par la longueur d’onde du rayonnement qu’ils utilisent. La résolution et le grossissement plus grands du microscope électronique sont dus au fait que la longueur d’onde d’un électron (longueur d’onde de de Broglie) est beaucoup plus petite que celle d’un photon de lumière visible.

Microscope à sonde locale

Cette technique d’imagerie, plus récente, est assez différente des deux premières puisqu’elle consiste à approcher une sonde (pointe) de la surface d’un objet pour en obtenir les caractéristiques.

Les microscopes à sondes locales peuvent déterminer la topographie de la surface d’un échantillon (microscope à force atomique) ou encore la densité d’états électroniques de surfaces conductrices (microscope à effet tunnel). Par ailleurs, l’utilisation d’une sonde peut permettre de collecter des ondes évanescentes confinées au voisinage d’une surface (microscope optique en champ proche).

La sonde balaye la surface de l’échantillon à représenter ce qui impose l’observation de surfaces relativement planes.

Suivant le microscope utilisé la résolution spatiale peut atteindre l’échelle atomique.

Types de microscopie électronique

Microscope électronique de transmission (MET ou TEM)

Dans ce cas, un objet est irradié par des électrons. Les microscopes TEM (microscopes électroniques de transmission) sont comme les microscopes de lumière transmise, où l’absorption joue un rôle important. Actuellement la résolution obtenue est d’environ 0,05 nm.

La forme originale de microscope électronique, le microscope électronique en transmission (MET) utilise un tungstène comme cathode source d’électrons. Le faisceau d’électrons est accéléré par une anode en général à 100 keV (40 à 400 keV) par rapport à la cathode, concentré par des lentilles électrostatiques et électromagnétiques, et transmis sur la cible qui est en partie transparente pour les électrons et en partie les disperse. Quand il ressort de l’échantillon, le faisceau d’électrons comporte des informations sur la structure de l’échantillon qui sont amplifiées par le système de lentilles de l’objectif du microscope. La variation spatiale de cette information (l ’« image ») est vue par projection de l’image électronique agrandie sur un scintillateur, tels que le sulfure de zinc ou le phosphore. L’image peut être enregistrée photographiquement par l’exposition d’un film ou une plaque photographique directement sur le faisceau d’électrons ou une plaque phosphorée à haute résolution peut être couplée au moyen d’un système optique ou d’une fibre optique vers le capteur d’une caméra CCD (Charge-Coupled Device). L’image détectée par le CCD peut être affichée sur un moniteur ou dirigée vers un ordinateur. La résolution est limitée essentiellement par l’aberration sphérique, mais une nouvelle génération de correcteurs sphériques augmente la résolution. Le logiciel de correction de l’aberration sphérique pour le MET à haute résolution (HRTEM) a permis la production d’images avec une résolution suffisante pour montrer les atomes de carbone dans des diamants, séparés par seulement 0,89 ångström (89 picomètres) et les atomes de silicium à 0,78 ångström (78 picomètres) au grossissement de 50 millions de fois. La capacité à déterminer la position des atomes dans des matériaux a fait de la HRTEM un outil important pour la recherche et de développement dans la nanotechnologie.

Microscope électronique à balayage (REM), Scanning Elektron Microscopy (MEB ou SEM)

Le microscope électronique à balayage (MEB ou SEM : Scanning Electron Microscope) est à la microscopie électronique ce que le microscope stéréoscopique est à la microscopie photonique. C’est-à-dire que son utilité relève de l’observation fine de la surface des objets. Ici, les électrons, comme les photons dans le cas du microscope photonique, ne doivent pas traverser l’objet, mais seulement se « réfléchir » à sa surface. La préparation des échantillons est de ce fait fortement simplifiée, puisque leur épaisseur ne doit pas être réduite à quelques centièmes de micromètres, comme c’est le cas avec le microscope électronique par transmission.

Ici est dirigé un faisceau d’électrons finement concentré dans une réticule déterminée sur l’échantillon métallisé. Les électrons secondaires (contraste) émis depuis la surface se mesurent comme un signal et se convertissent en une image optique. Pour atteindre un faisceau d’électrons non-interrompu, la mesure se réalise dans un grand vide.

À la différence du MET, où le faisceau d’électrons à haute tension porte l’image de l’échantillon, le faisceau d’électrons du microscope électronique à balayage (MEB, ou SEM en anglais) ne peut donner à aucun moment une image complète de l’échantillon. Le SEM produit des images par sondage de l’échantillon avec un faisceau d’électrons qui, concentré, est analysé sur une zone rectangulaire de l’échantillon (raster scanning (en)). Sur chaque point sur l’échantillon le faisceau d’électrons incident perd de l’énergie. Cette perte d’énergie est convertie en autres formes, comme la chaleur, l’émission d’électrons secondaires de basse énergie, l’émission de lumière (cathodoluminescence) ou l’émission de rayons X. L’afficheur du SEM représente l’intensité variable de l’un de ces signaux dans l’image, dans une position correspondant à la position du faisceau sur l’échantillon lorsque le signal a été généré. Dans l’image de la fourmi de droite, l’image a été construite à partir des signaux produits par un détecteur d’électrons secondaires, le mode d’imagerie conventionnelle normal de la plupart des SEM. 

En règle générale, la résolution de l’image d’un SEM est d’environ un ordre de grandeur plus faible que celle d’un MET. Toutefois, parce que l’image du SEM repose sur les processus de surface plutôt que sur la transmission, il est en mesure de livrer des images d’objets de plusieurs centimètres avec une grande profondeur de champ, dépendant de la conception et du réglage de l’instrument, et il peut ainsi produire des images qui sont une bonne représentation en trois dimensions de la structure de l’échantillon.

Microscope RHEED

Microscope SLEEM

Microscope électronique par réflexion, Reflection High Energy Electron Diffraction (RHEED) ou Spin-Polarized Low-Energy Electron Microscopy (SPLEEM),

Dans le microscope électronique par réflexion, comme dans le microscope électronique en transmission, un faisceau d’électrons est incident sur une surface mais, au lieu d’utiliser la transmission (MET) ou des électrons secondaires (SEM), c’est le faisceau réfléchi d’électrons, dispersés par élasticité, qui est détecté. Cette technique est généralement associée à la Reflection High Energy Electron Diffraction (RHEED) et la réflexion à haute énergie du spectre de perte (RHELS). Une autre variante est Spin-Polarized Low-Energy Electron Microscopy (SPLEEM), qui est utilisé pour regarder la microstructure de domaines magnétiques.

Microscope électronique à balayage en transmission, Scanning transmission electron microscopy (MEBT, ou STEM)

Le microscope électronique à balayage par transmission (MEBT, ou STEM pour Scanning transmission electron microscopy) est un type de modèle dont le principe de fonctionnement allie certains aspects du microscope électronique à balayage et du microscope électronique en transmission. Une source d’électrons focalise un faisceau d’électrons qui traverse l’échantillon. Un système de lentilles magnétiques permet à ce faisceau de balayer la surface de l’échantillon à analyser.

Un microscope électronique à transmission à balayage (STEM) est un type de microscope électronique à transmission (TEM). La prononciation est [stɛm] ou [ɛsti : i : m]. Comme avec un microscope électronique à transmission classique (CTEM), les images sont formées par des électrons traversant un échantillon suffisamment mince. Cependant, contrairement à CTEM, dans STEM, le faisceau d’électrons est focalisé sur un point fin (avec une taille de point typique de 0,05 à 0,2 nm), qui est ensuite balayé sur l’échantillon dans un système d’éclairage par trame construit de manière à ce que l’échantillon soit éclairé à chaque point avec le faisceau parallèle à l’axe optique. Le tramage du faisceau sur l’échantillon rend STEM adapté aux techniques analytiques telles que l’imagerie en fond noir annulaire à contraste Z et la cartographie spectroscopique par spectroscopie par rayons X à dispersion d’énergie (EDX) ou par spectroscopie de perte d’énergie électronique (EELS). Ces signaux peuvent être obtenus simultanément, permettant une corrélation directe des images et des données spectroscopiques.

Un STEM typique est un microscope électronique à transmission classique équipé de bobines de balayage supplémentaires, de détecteurs et des circuits nécessaires, ce qui lui permet de basculer entre un fonctionnement en tant que STEM ou CTEM ; cependant, les STEM dédiés sont également fabriqués

Microscope de force atomique, Atomic Force Microscopy (AFM)

Cette méthode sert à présenter une présentation superficielle. L’échantillon est palpé dans un réticule prédéfini par une pointe affilée fixée à un ressort à lames. Grâce à la force nucléaire, la distance se maintient constante à la surface. La déformation du ressort à lames est captée par la réflexion du faisceau de lumière laser par un capteur optique, et présenté par lignes. Selon la rugosité à vérifier, vous pouvez détecter des différences dans une plage de 0,1 à 10 nm.

L’AFM est un type de microscopie à sonde à balayage (SPM), avec une résolution démontrée de l’ordre du nanomètre, plus de 1000 fois supérieure à la limite de diffraction optique. Les informations sont recueillies en "touchant" ou "touchant" la surface avec une sonde mécanique. Les éléments piézoélectriques qui facilitent des mouvements minuscules mais précis et précis sur commande (électronique) permettent un balayage précis

L’AFM a trois capacités principales : la mesure de la force, l’imagerie et la manipulation.

En mesure de force, les AFM peuvent être utilisés pour mesurer les forces entre la sonde et l’échantillon en fonction de leur séparation mutuelle. Cela peut être appliqué pour effectuer une spectroscopie de force, pour mesurer les propriétés mécaniques de l’échantillon, telles que le module de Young de l’échantillon, une mesure de la rigidité.

Pour l’imagerie, la réaction de la sonde aux forces que l’échantillon lui impose peut être utilisée pour former une image de la forme tridimensionnelle (topographie) de la surface d’un échantillon à haute résolution. Ceci est obtenu en balayant de façon raster la position de l’échantillon par rapport à la pointe et en enregistrant la hauteur de la sonde qui correspond à une interaction constante sonde-échantillon (voir la section Imagerie topographique dans AFM pour plus de détails). La topographie de surface est généralement affichée sous forme de graphique pseudocolor.

Lors de la manipulation, les forces entre la pointe et l’échantillon peuvent également être utilisées pour modifier les propriétés de l’échantillon de manière contrôlée. Des exemples en sont la manipulation atomique, la lithographie par sonde à balayage et la stimulation locale de cellules.

Simultanément à l’acquisition d’images topographiques, d’autres propriétés de l’échantillon peuvent être mesurées localement et affichées sous forme d’image, souvent avec une résolution similaire. Des exemples de telles propriétés sont les propriétés mécaniques telles que la rigidité ou la force d’adhérence et les propriétés électriques telles que la conductivité ou le potentiel de surface. En fait, la majorité des techniques SPM sont des extensions d’AFM qui utilisent cette modalité.

Microscope à balayage à effet tunnel, Scanning Tunnelling Microscopy (STM)

Dans la microscopie à effet tunnel se présente la surface à travers la mesure du flux du courant entre la pointe conductrice et l’échantillon qui est aussi conducteur. Les échantillons qui ne sont pas conducteurs doivent être métallisés avec de l’or, du graphite ou du chrome. Dans ce cas, la surface est aussi palpée dans un réticule prédéfini.

Le microscope à effet tunnel rend possible l’analyse des surfaces dans le domaine de la physique des surfaces et dans le domaine de la biologie (résolution atomique de petites molécules organiques). Les informations recueillies sont un mélange de la structure électronique et de l’aménagement géométrique des atomes. Le STM utilise un phénomène quantique : l’effet tunnel. La tension appliquée entre la sonde métallique ultra fine (extrémité : 0.2nm) à moins d’un nanomètre d’un matériau conducteur entraîne des sauts d’électrons plus ou moins nombreux.

Cet appareil permet de visualiser une surface conductrice en mesurant le courant électrique qui circule entre celle-ci et la pointe extrêmement fine (moins d’un nanomètre) du microscope. Malgré l’absence de contact entre les deux , les électrons peuvent en effet passer de l’une à l’autre grâce à un phénomène quantique appelé "effet tunnel". Ainsi, à partir de la position de la pointe dans l’espace et de la valeur du courant (qui dépend de la distance entre les deux éléments), un ordinateur peut déduire la forme exacte de la surface à l’atome prés.

Le microscope à effet tunnel permet également de déplacer les atomes, un par un. En effet, la force entre deux atomes est attractives à longue distance ou répulsive à courte distance.Ainsi, en "poussant" ou "tirant chaque atome, peut-on construire n’importe quel matériau.Mais le processus est particulièrement lent.

Microscope optique à effet tunnel, Photon Scanning Tunnel Microscope (PSTM)

Une pointe diélectrique de forme et de nature adaptée capte ou émet de la lumière à une distance de quelques millièmes de micromètre de la surface de l’objet à étudier. Le champ électromagnétique possédant une structure très particulière, le mélange d’ondes capables de se propager et d’ondes confinées sur la surface (contenant l’information sur la structure fine de l’objet) a donné aux microscopes l’appellation de tunnel optique en raison de la nature évanescente des ondes (similitude avec le STM qui détecte des électrons "évanescents").

Le fonctionnement d’un microscope à effet tunnel à photons (PSTM) est analogue à celui d’un microscope à effet tunnel à électrons (ESTM), la principale distinction étant que le PSTM implique la tunnellisation de photons au lieu d’électrons de la surface de l’échantillon à l’extrémité de la sonde. Un faisceau de lumière est focalisé sur un prisme à un angle supérieur à l’angle critique du milieu réfractif afin d’induire une réflexion interne totale (TIR) à l’intérieur du prisme. Bien que le faisceau de lumière ne se propage pas à la surface du prisme à réfraction sous TIR, un champ de lumière évanescent est toujours présent à la surface.

Le champ évanescent est une onde stationnaire qui se propage à la surface du milieu et décroît de façon exponentielle avec l’éloignement de la surface. L’onde de surface est modifiée par la topographie de l’échantillon, qui est placé à la surface du prisme. En plaçant une pointe de sonde électriquement conductrice affûtée très près de la surface (à une distance <λ), les photons sont capables de se propager à travers l’espace situé entre la surface et la sonde (espace qu’ils ne pourraient autrement pas occuper) par tunnel , permettant de détecter les variations du champ évanescent et donc les variations de la topographie de surface de l’échantillon. De cette manière, PSTM est en mesure de cartographier la topographie de surface d’un échantillon de la même manière qu’en ESTM.

Un des principaux avantages du PSTM est qu’une surface électriquement conductrice n’est plus nécessaire. Cela simplifie beaucoup l’imagerie des échantillons biologiques et élimine le besoin de recouvrir les échantillons d’or ou d’un autre métal conducteur. De plus, le PSTM peut être utilisé pour mesurer les propriétés optiques d’un échantillon et peut être couplé à des techniques telles que la photoluminescence, l’absorption et la spectroscopie Raman.

Microscope optique en champ proche, Scanning Near-field Optical Microscope (SNOM ou NSOM)

Il utilise la présence d’ondes optiques évanescentes à la périphérie immédiate d’une surface transparente, qui sont captées par une sonde locale (fibre taillée en pointe).

Le microscope optique en champ proche (MOCP, ou SNOM pour scanning near-field optical microscope) est un type de microscope à sonde locale qui permet d’imager des objets à partir de la détection des ondes évanescentes confinées au voisinage de leur surface (détection en champ proche optique).

Le MOCP permet de compenser la diffraction, une des limitations de la microscopie optique. En effet, lorsqu’un objet, ou le détail d’un objet, est plus petit que la longueur d’onde de la lumière qui l’éclaire, la lumière est diffusée sous la forme d’une tache, on ne peut donc pas avoir une image nette du détail.

Une des manières de résoudre ce problème consiste à placer le détecteur de lumière très proche de la surface. Ainsi, on observe l’onde évanescente et non pas l’onde dispersée. On peut donc visualiser des détails plus petits que la longueur d’onde de la lumière. La lumière est apportée et récupérée par une fibre optique ; la surface observée est limitée par un trou plus petit que la longueur d’onde de la lumière. On peut travailler avec la fluorescence de l’échantillon afin d’avoir des informations sur les propriétés physiques et chimiques de la matière. L’échantillon peut être observé en réflexion ou en transmission (en transparence).

Microscope à rayons X

Dans la microscopie à rayons X, les rayons X sont utilisés comme source de radiation. Grâce à la longueur d’onde plus courte des rayons X par rapport à la lumière, la résolution obtenue est plus élevée. Un grand avantage de la microscopie à rayons X est que les échantillons peuvent être plus épais qu’en utilisant des microscopes électroniques. Il ne demande pas que la surface soit conductrice, ni une coloration du matériel biologique, ni une utilisation d’un substrat ni de couper l’échantillon de façon très fine.

Par rapport au rayonnement visible (la lumière), les rayons X traversent certains matériaux opaques et sont interceptés par d’autres (plomb notamment), sans provoquer de reflets ni de halos, et tout en réfractant facilement. Ces rayons sont invisibles à l’œil humain, mais peuvent être enregistrés par des caméras spéciales. Le principe consiste donc à disposer un échantillon dans un faisceau de rayons X et de photographier via un dispositif (détecteurs CCD) sensible aux rayons X le rayonnement qui a traversé l’échantillon. Une technologie dite d’imagerie de contraste utilise ensuite la différence d’absorption des « rayons X mous » dans la fenêtre de l’eau (région de longueur d’onde : 2,3 - 4,4 nm, la région d’énergie des photons étant de 0,28 à 0,53 keV), celle de l’atome de carbone (principal élément qui composent la cellule vivante) et l’atome d’oxygène (composant principal de l’eau).

Microscope à métalentilles

Récemment, un substitut aux lentilles optiques classiques a été mis au point et testé avec succès. Il s’agit d’une sorte de puce plate et transparente (en deux dimensions donc) formant une « métalentilles » sur laquelle a été déposé un réseaux d’ailettes métalliques (TiO) nanométriques. Ce dispositif qui permet déjà en laboratoire une image de qualité à un grossissement 170 ×, pourrait à l’avenir permettre de produire des lentilles très petites, plates, et très légères, sans doute moins chères que les bonnes lentilles faites en verres spéciaux poli1. Des microscopes, mais aussi des appareils photo, téléphones portables ou des lentilles de contacts spéciales ou des micro- ou nanodrones pourraient en être équipés. La microscopie laser, diverses formes d’imagerie et la spectroscopie pourraient en bénéficier. De telles pseudolentilles pourraient aussi améliorer les réseaux nanophotoniques. Ces dispositifs doivent encore être améliorés pour ne pas distordre les "couleurs" ou permettre de voir un plus large spectre de longueur d’onde à partir d’une même « métalentilles ».

Sources : Lochak, Diner, Farge, Feynman, Roditchev, PCEM Instruments, Wikipedia,

Exposés en vidéos :

Observation d’objets transparents en microscopie optique à fond noir, Canal U, exposé de Françon

Du microscope électronique à la microscopie à champ proche, Université de tous les savoirs, exposé de Klein

Microscope électronique, Science en cours, Exposé de Descamps, Fabre, Lassale, Marcel

Microscope à effet tunnel, Canal U, exposé de Guyon, Livrozet

Microscope en champ proche, Université de tous les savoirs, exposé de Roditchev

Microscopie électronique, Canal U, Université Paris Diderot

Microscope électronique à balayage, Science en cours, exposé de Borensztajn

Microscope électronique en transmission, Science en cours, exposé de Boisset

Techniques de super-résolution en microscopie électronique, Université Paris-Sud, exposé

Microscope tomographique, Canal U, exposé

Microscope à effet tunnel, Science en cours, exposé de Grandidier

Microscopie par interférences en lumière polarisée, Canal U, exposé de Françon

Transformer son smartphone en microscope, Canal U, exposé de Delabre

Le microscope dans l’Encyclopédie de Diderot-d’Alembert-Jaucourt

Le microscope en 1748

Le microscope en 1839

« La Physique moderne et le déterminisme », Paul Langevin :

« Le microscope d’Heisenberg

« Δp * Δq = h

C’est bien là la relation d’incertitude d’ Heisenberg obtenue comme conséquence du fait expérimental de la diffraction des ondes électroniques. On retrouve encore cette relation lorsqu’on cherche à préciser au maximum la position d’un électron au moyen d’un appareil analogue à un microscope : c’est le célèbre microscope de Heisenberg. Nous envoyons de la lumière sur l’électron : l’électron la renvoie dans la direction de l’observateur, et le point où se forme la tache lumineuse sur l’oculaire du microscope nous indique la position de l’électron au moment considéré. Plus la tache sera petite, mieux sera connue la position. Or les dimensions de cette tache lumineuse sont, toujours en raison des phénomènes de diffraction, fixées par la longueur d’onde de la lumière utilisée. Si l’on veut avoir une grande précision sur la position de l’électron, il faut réduire au maximum les dimensions de la tache et, pour cela, utiliser une lumière de longueur d’onde la plus faible possible. Mais alors la loi des quanta nous indique que l’énergie de cette radiation sera très grande : lorsqu’elle va rencontrer notre électron, celui-ci va subir un recul très important, d’autant plus important que la longueur d’onde sera plus petite : si nous voulons connaître très exactement la position de l’électron, sa vitesse, par suite du recul, sera très mal connue. Inversement, si nous voulons connaître très exactement la vitesse de l’électron, il suffira de l’éclairer avec de la lumière de très grande longueur d’onde et de mesurer les modifications que l’électron lui fait subir (effet Doppler) ; mais la tache de diffraction est alors énorme, et la position de l’électron est très mal définie. On a toujours, comme précédemment, Δp * Δq = h. On est parti de ce résultat pour proclamer la faillite du déterminisme. »

Etienne Klein dans « Petit voyage dans le monde des quanta » :

« L’effet tunnel intervient dans tous les phénomènes mettant en jeu atomes, électrons, noyaux et autres particules. Par exemple, deux noyaux atomiques peuvent fusionner même si leur vitesse relative est inférieure à celle qui serait nécessaire pour vaincre la répulsion électrique qu’ils exercent l’un sur l’autre. Dans un tout autre domaine, celui de l’électronique, de nombreux dispositifs sont fondés sur la possibilité qu’a un électron de franchir par effet tunnel des zones interdites par la physique classique. On peut citer l’exemple du microscope à effet tunnel, qui fut inventé en 1981 : une pointe métallique mise sous tension survole à quelques dixièmes de nanomètre (dix puissance moins dix mètre) d’altitude la surface que l’on souhaite examiner. Par effet tunnel, des électrons peuvent passer de la pointe métallique à la surface, en traversant l’espace vide qui les sépare, même s’ils n’ont pas l’énergie requise selon les critères de la physique classique. Le taux d’électrons qui traversent est extrêmement sensible à la distance qui sépare la pointe de la surface, de sorte qu’en ajustant finement l’altitude de la pointe, de façon à garder constant le « courant tunnel », on parvient à cartographier le relief des surfaces de façon très précise. (…) Nous avons montré à propos du principe d’Heisenberg, que l’impulsion d’une particule n’est en général pas clairement définie. A cette dispersion de l’impulsion correspond une dispersion de l’énergie cinétique qui peut s’étendre au-delà de l’énergie potentielle de la barrière. Il existe donc une probabilité non nulle que la particule ait assez d’énergie pour passer par-dessus le sommet de la barrière. »

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